"INGAT....!!!!!"

"IKATLAH ILMU DENGAN MENULISKANNYA......"
"ILMU PENGETAHUAN TANPA AGAMA ADALAH PINCANG..."

Sabtu, 08 Oktober 2011

uji hopkins-cole & ninhidrin

Oleh:
Dewi Susylowati (0803061001)
Widhiarty Soetopo (0803061003)
Dewa Ayu Angga Pebriani (0803061010)
JURUSAN : BUDIDAYA KELAUTAN
FAKULTAS MIPA
UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA

ABSTRAK
Protein dapat dalam molekul pro molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim, rotein akan menghasilkan asam-asam amino. Ada dua puluh jenis asam amino yang terdapat dalam molekul protei. Asam-asam amino ini terikat satu sama lain ole ikatan peptida. Protein mudah dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH, dan pelarut organik.

Kata kunci: pelarut, protein, asam amino.

PENDAHULUAN
protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dn pengatur. Protein adlaah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992).
Protein merupakan suatu polipeptida dengan BM yang sangat bervariasi dari 5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang besar, protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, solven organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji, 1996).
Struktur asam amino digambarkan sebagai berikut:


                                                           H

H2N                C              COOH

                                                           R
                                                                                                (Lehninger, 1995).
Apabila asam amino larut dalam air, gugus karboksilat akan melepaskan ion H+, sedangkan gugus amina akan menerima ion H+, seperti reaksi berikut:
Oleh adanya kedua gugus tersebut asam amino dalam larutan dapat membentuk ion yang bermuatan positif dan juga bermuatan negatif atau disebut juga ion amfoter (zwitterion). Keadaan ion ini sangat tergantung pada pH larutan. Apabila asam amino dalam air ditambah dengan basa, maka asam amino akan terdapat dalam bentuk (I) karena konsentrasi ion OH- yang tinggi mampu mengikat ion-ion H+ pada gugus –NH3+. Sebaliknya bila ditambahkan asam ke dalam larutan asam amino, maka konsentrasi ion H+ yang tinggi mampu berikatan dengan ion –COO- sehingga terbentuk gugus –COOH sehingga asam amino akan terdapat dalam bentuk (II) (Anna Poedjiadi, 1994).
Dalam suatu sistem elektroforesis yang memiliki elektroda positif dan negatif, asam amino akan bergerak menuju elektroda yang berlawanan dengan muatan asam amino yang terdapat dalam larutan. Apabila ion asam amino tidak bergerak ke arah negatif maupun positif  dalam suatu sistem elektroforesis maka pH pada saat itu disebut pH isolistrik. Pada pH tersebut terdapat keseimbangan antara bentuk-bentuk asam amino sebagai ion amfoter, anion dan kation (Anna Poedjiadi, 1994).
Gugus karboksil pada asam amino dapat dilepas dengan proses dekarboksilasi dan menghasilkan suatu amina. Gugus amino pada asam amino dapat bereaksi dengan asam nitrit dan melepaskan gas nitrogen yang dapat diukur volumenya. Van Slyke menggunakan reaksi ini untuk menentukan gugus amino bebas pada asam amino, peptida maupun protein. (Anna Poedjiadi, 1994).
Pada dasarnya suatu peptida adalah asil-asam amino, karena gugus –COOH dan –NH2 membentuk ikatan peptida. Peptida didapatkan dari hidrolisis protein yang tidak sempurna. Apabila peptida yang dihasilkan dihidrolisis lebih lanjut akan dihasilkan asam-asam amino. (Anna Poedjiadi, 1994).
Sifat peptida ditentukan oleh gugus –COOH, –NH2 dan gugus R. Sifat asam dan basa pada peptida ditentukan oleh gugus –COOH dan –NH2 , namun pada rantai panjang gugus –COOH dan –NH2  yang terletak diujung rantai tidak lagi berpengaruh. Suatu peptida juga mempunyai titik isolistrik seperti pada asam amino. Reaksi biuret merupakan reaksi warna untuk peptida dan protein. (Anna Poedjiadi, 1994).
Struktur protein dapat dibagi menjadi empat bentuk; primer, sekunder, tersier dan kuartener. Susunan linier asam amino dalam protein merupakan struktur primer. Susunan tersebut akan menentukan sifat dasar protein dan bentuk struktur sekunder serta tersier. Bila protein menandung banyak asam amino dengan gugus hidrofobik, daya kelarutannya kurang dalam air dibandingkan dengan protein yang banyak mengandung asam amino dengan gugus hidrofil. (Winarno, 1992).
Protein yang terdapat dalam bahan pangan mudah mengalami perubahan-perubahan, antara lain:
1.      Dapat terdenaturasi oleh perlakuan pemanasan.
2.      Dapat terkoagulasi atau mengendap oleh perlakuan pengasaman.
3.      Dapat mengalami dekomposisi atau pemecahan oleh enzim-enzim proteolitik.
4.      Dapat bereaksi dengan gula reduksi, sehingga menyebabkan terjadinya warna coklat.
Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhdap struktur sekunder, tersier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Karena itu denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan atau wiru molekul protein. (Winarno, 1992).

Denaturasi protein
Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tertier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovelen. Karena itu, denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hydrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan aterbukanya lipatan atau wiru molekul protein (Winarno, 1992).
Protein yang terdenaturasi akan berkurang kelarutannya. Lapisan molekul bagian dalam yang ersifat hidrofobik akan keluar sedangkan bagian hidrofilik akan terlipat ke dalam. Pelipatan atau pembakikkan akan terjadi bila protein mendekati pH isoelektris lalu protein akan menggumpal dan mengendap. Viskositas akan bertambah karena molekul mengembang menjadi asimetrik, sudut putaran optis larutan protein juga akan meningkat (Winarno, 1992).
            Denaturasi protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Sejak diketahui reaksi denaturasi tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan peptida, dimana struktur primer protein tetap sama setelah proses denaturasi. Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur sekunder dan tersier protein. Pada struktur protein tersier terdapat empat jenis interaksi yang membentuk ikatan pada rantai samping seperti; ikatan hidrogen, jembatan garam, ikatan disulfida dan interaksi hidrofobik non polar, yang kemungkinan mengalami gangguan. Denaturasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi protein (Ophart, C.E., 2003).
(Ophart, C.E., 2003).

Denaturasi karena Panas:
            Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Protein telur mengalami denaturasi dan terkoagulasi selama pemasakan. Beberapa makanan dimasak untuk mendenaturasi protein yang dikandung supaya memudahkan enzim pencernaan dalam mencerna protein tersebut (Ophart, C.E., 2003).
Pemanasan akan membuat protein bahan terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida. Proses ini biasanya berlangsung pada kisaran suhu yang sempit (Ophart, C.E., 2003).
Alkohol dapat merusak ikatan hidrogen:
            Ikatan hidrogen terjadi antara gugus amida dalam struktur sekunder protein. Ikatan hidrogen antar rantai samping terjadi dalam struktur tersier protein dengan kombinasi berbagai asam amino penyusunnya (Ophart, C.E., 2003).
(Ophart, C.E., 2003)
Denaturasi karena Asam dan basa:
Protein akan mengalami kekeruhan terbesar pada saat mencapai ph isoelektris yaitu ph dimana protein memiliki muatan positif dan negatif yang sama, pada saat inilah protein mengalami denaturasi yang ditandai kekeruhan meningkat dan timbulnya gumpalan. (Anna, P., 1994).    Asam dan basa dapat mengacaukan jembatan garam dengan adanya muatan ionik. Sebuah tipe reaksi penggantian dobel terjadi sewaktu ion positif dan negatif di dalam garam berganti pasangan dengan ion positif dan negatif yang berasal dari asam atau basa yang ditambahkan. Reaksi ini terjadi di dalam sistem pencernaan, saat asam lambung mengkoagulasi susu yang dikonsumsi (Ophart, C.E., 2003).
(Ophart, C.E., 2003)
Denaturasi karena Garam logam berat:
            Garam logam berat mendenaturasi protein sama dengan halnya asam dan basa. Garam logam berat umumnya mengandung Hg+2, Pb+2, Ag+1 Tl+1, Cd+2 dan logam lainnya dengan berat atom yang besar. Reaksi yang terjadi antara garam logam berat akan mengakibatkan terbentuknya garam protein-logam yang tidak larut (Ophart, C.E., 2003).
Protein akan mengalami presipitasi bila bereaksi dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam) diperlukan ph larutan diatas pi karena protein bermuatan negatif, pengendapan oleh ion negatif diperlukan ph larutan dibawah pi karena protein bermuatan positif. Ion-ion positif yang dapat mengendapkan protein adalah; Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, Cu++ dan Pb++, sedangkan ion-ion negatif yang dapat mengendapkan protein adalah; ion salisilat, triklorasetat, piktrat, tanat dan sulfosalisilat. (Anna, P., 1994).
Garam logam berat merusak ikatan disulfida:
            Logam berat juga merusak ikatan disulfida karena affinitasnya yang tinggi dan kemampuannya untuk menarik sulfur sehingga mengakibatkan denaturasi protein (Ophart, C.E., 2003).
Agen pereduksi merusak ikatan disulfida:
            Ikatan disulfida terbentuk dengan adanya oksidasi gugus sulfhidril pada sistein. Antara rantai protein yang berbeda yang sama-sama memiliki gugus sulfhidril akan membentuk ikatan disulfida kovalen yang sangat kuat. Agen pereduksi dapat memutuskan ikatan disulfida, dimana penambahan atom hidrogen sehingga membentuk gugus tiol; -SH (Ophart, C.E., 2003).
(Ophart, C.E., 2003)
Protein yang terdenaturasi akan berkurang kelarutannya. Lapisan molekul protein  bagian dalam yang bersifat hidrofobik akan keluar, sedangkan bagian yang hidrofilik akan terlipat ke dalam. Pelipatan atau pembalikkan terjadi bila larutan protein mendekati pH isoelektris, lalu protein akan menggumpal dan mengendap. Viskositas akan bertambah karena molekul mengembang dan menjadi asimetrik, sudut putaran optis larutan protein juga akan meningkat. Denaturasi protein dapat disebabkan oleh panas, pH, bahan kimia, mekanik dan lain-lain. (Winarno, 1992).
Protein akan mengalami presipitasi bila bereaksi dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam) diperlukan ph larutan diatas pi karena protein bermuatan negatif, pengendapan oleh ion negatif diperlukan ph larutan dibawah pi karena protein bermuatan positif. Ion-ion positif yang dapat mengendapkan protein adalah; Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, Cu++ dan Pb++, sedangkan ion-ion negatif yang dapat mengendapkan protein adalah; ion salisilat, triklorasetat, piktrat, tanat dan sulfosalisilat. (Anna, P., 1994).
Protein akan mengalami kekeruhan terbesar pada saat mencapai ph isoelektris yaitu pH dimana protein memiliki muatan positif dan negatif yang sama, pada saat inilah protein mengalami denaturasi yang ditandai kekeruhan meningkat dan timbulnya gumpalan. (Anna, P., 1994).

TUJUAN
Tujuan dari praktikum ini:
  1. Untuk melakukan uji Hopkins-Cole dan uji Ninhidrin sesuai prosedur yang ada.
  2. Untuk menganalisis asam amino dan gugusnya.
  3. Untuk mendeteksi gugus NH3 dalam asam amino bereaksi dengan ninhidrin sehingga menhasilkan warna ungu kemerahan.

METODELOGI
A).       Alat dan bahan uji Hopkins-Cole
Alat-alat yang diperlukan:
J   Gelas arloji
J   Neraca analitik
J   Labu ukur
J   Tabung reaksi
J   Pipet volum
J   Pipet tetes
J   Batang pengaduk
J   Gelas kimia
J   Botol
J   Tissue
J   Lap
Bahan yang diperlukan:
J   Larutan protein (albumin telur (1:5))
J   Reagen Hopkins-Cole
J   Larutan asam amino 1% ( tirosin, triptofan, glisin, fenilalanin)
J   Larutan H2SO4  pekat

B).       Alat dan Bahan Uji Ninhidrin
            Alat-alat yang diperlukan:
J   Gelas arloji
J   Neraca analitik
J   Labu ukur
J   Tabung reaksi
J   Pipet tetes
J   Batang pengaduk
J   Gelas kimia
J   Botol
J   Tissue
J   Lap
J   Penangas air
Bahan yang diperlukan:
J   Larutan protein (albumin telur (1:5))
J   Larutan ninhidrin 0,1%
J   Larutan asam amino 1% ( tirosin, triptofan, glisin, fenilalanin)

Langkah Kerja
A.                Pembuatan Larutan asam amino (fenilalanin) 1 %, 50 mL.
Untuk membuat 50 mL larutan fenilalanin 1 %, berarti diperlukan 0,5 gram fenilalanin. Ke dalam 0,5 gram fenilalanin ditambahkan air 20 mL aquades, kemudian diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen. Setelah larutan benar-benar tercampur, masukan ke dalam labu ukur 50 mL, kemudian tambahkan aquades hingga batas 50 mL. Dikocok perlahan dan tempatkan pada botol.
B.                 Uji Hopkins-Cole
Ke dalam 2 mL larutan protein ditambahkan 2 mL Reagen Hopkins-Cole. Kemudian tambahkan larutan H2SO4  pekat secara perlahan-lahan sebanyak ±5 mL melalui dinding tabung reaksi. Lihat warna yang terbentuk pada pertemuan kedua larutan tersebut. Bila perlu putar perlahan untuk mengamati cincin yang terbentuk. Lakukan percobaan yang sama pada semua larutan asam amino secara bergantian.
C.                 Uji Ninhidrin
Ke dalam 3 mL larutan protein ditambahkan 0,5 mL larutan ninhidrin 0,1%. Kemudian panaskan hingga mendidih dengan penangas air. Lakukan percobaan pada larutan asam amino secara bergantian.

HASIL DAN PEMBAHASAN
  1. Pengujian Hopkins-Cole
NO
PROSEDUR KERJA
HASIL PENGAMATAN
1.
Memasukkan 2 mL sampel ke dalam tabung reaksi:
  • Larutan protein
  • Larutan glisin
  • Larutan tirosin
  • Larutan fenilalanin
  • Larutan triptofan


  • Keruh
  • Bening
  • Keruh
  • Bening
  • Bening
2.
Ditambahkan 2 mL reagen Hopkins-Cole ke dalam sampel.
  • Larutan protein + Reagen Hopkins-Cole

  • Larutan glisin + Reagen Hopkins-Cole
  • Larutan tirosin + Reagen Hopkins-Cole
  • Larutan fenilalanin + Reagen Hopkins-Cole
  • Larutan triptofan + Reagen Hopkins-Cole



  • Bening (ada endapan dan gelembung)
  • Bening
  • Bening
  • Bening
  • Bening
3.
Larutan yang telah dicampur dengan reagen, kemudian ditambahkan sedikit demi sedikit H2SO4  pekat secara perlahan-lahan sebanyak ±5 mL melalui dinding tabung reaksi.
  • Larutan protein + Reagen Hopkins-Cole + H2SO4


  • Larutan glisin + Reagen Hopkins-Cole + H2SO4
  • Larutan tirosin + Reagen Hopkins-Cole + H2SO4
  • Larutan fenilalanin + Reagen Hopkins-Cole + H2SO4
  • Larutan triptofan + Reagen Hopkins-Cole + H2SO4





  • Terbentuk 4 lapisan, dari atas ke bawah: putih susu, putih keunguan, ungu, dan bening.
  • Bening

  • Bening (saat direaksikan ada uap)
  • Bening (saat direaksikan ada uap)
  • Awal reaksi berwarna kuning dan pada akhir reaksi berwarna hitam.

Tritofan dapat berkondensasi dengan beberap aldehid dengan bantuan asam kuat dan membentuk senyawa yang berwarna. Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pada dasarnya reaksi Hopkins-Cole memberi hasil positif khas untuk gugus indol dalam protein.
  1. Pengujian Ninhidrin
NO
PROSEDUR KERJA
HASIL PENGAMATAN
1.
0,5 mL larutan ninhidrin 0,1% ditambahkan ke dalam larutan sampel:
  • Larutan protein
  • Larutan glisin
  • Larutan tirosin
  • Larutan fenilalanin
  • Larutan triptofan




  • Keruhnya berkurang, terbentuk endapan.
  • Larutan berwarna ungu.
  • Larutan berwarna ungu muda.
  • Bening dan terbentuk endapan.
  • Berwarna ungu pudar.
2.
Larutan dipanaskan hingga mendidih:
  • Larutan protein
  • Larutan glisin

  • Larutan tirosin
  • Larutan fenilalanin
  • Larutan triptofan



  • Larutan mengental dan berwarna ungu.
  • Terbentuk 2 lapisan: ungu (atas) dan bening (bawah).
  • Larutan berwarna biru tua.
  • Larutan berwarna ungu muda.
  • Larutan berwarna ungu tua.
3.
Setelah didinginkan
Semua sampel berwarna lebih gelap dari warna sebelumnya.
           
            Asam amino bebas adalah asam amino dimana gugus aminonya tidak terikat. Pada praktikum di atas, larutan protein, glisin, tirosin, triptofan dan fenilanalina membentuk warna ungu karena dapat bereaksi dengan Ninhidrin. Hal ini menandakan ketiga zat uji tersebut mempunyai gugus asam amino bebas.
           
            Semakin banyak ninhidrin pada zat uji yang dapat bereaksi, semakin pekat warnanya. Hal ini juga mendasari bahwa uji Ninhidrin dapat digunakan untuk menentukan asam amino secara kuantitatif.


PENUTUP
Berdasarkan hasil percobaan di atas, maka dapat ditarik simpulan sebagai berikut.
1.         Reaksi positif memberi hasil positif khas untuk gugus indol dalam protein.
2.         Semua asam amino atau peptida yang mengandung α-amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk senyawa kompleks berwarna biru.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim.2008.Pengantar dan Panduan dalam Melakukan Praktikum Kimia analis.Fakultas farmasi Universitas Muhammadyah Surakarta
Yazid, Estien, dkk.2006.Penuntun Praktikum BIOKIMIA untuk Mahasiswa Analis.Andi Offset: Yogyakarta
Anonim.2006.Protein.www.wikipedia.org.January, 2009.
Suryatna, Bambang Sugeng.2008.Buku Ajar Kimia Makanan.UNES Semarang.
Ngili, Yohanes.2009.Biokimia Struktur & Fungsi Biomolekul.Graha Ilmu: Yogyakarta.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar